Příprava histologických preparátů a histologické atlasy
Histologické vyšetření je důležité pro stanovení diagnózy nebo jako metoda vědecké práce. Nejdříve je ale potřeba zhotovit histologické preparáty, které jsou pro diagnózu klíčové. Jejich vytvoření není jednoduché, proto vědci a lektoři českých univerzit dali vzniknout několika histologickým atlasům.
K čemu slouží histologický preparát?
Histologické preparáty jsou mikroskopické preparáty, které slouží pro studium a buněčnou diagnostiku živých tkání. Díky preparátu dokáže medik prozkoumat mikroskopické struktury tkání, stanovit diagnózu a vyloučit případné patologie.
Histologie je ideální pro zobrazování celých tkání s nižším rozlišením, ale je omezující, pokud chcete zkoumat subcelulární struktury, například při studiu změn u mozkových nádorů. V takovém případě je zapotřebí podrobnější a výkonnější technika, jako je elektronová mikroskopie.
Zhotovení histologických preparátů
Příprava histologických preparátů se rozděluje do několika fází. Nejdříve je potřeba tkáně a buňky šetrně usmrtit, aby si zachovaly charakteristický tvar a strukturu. Následně se nařežou na tenké řezy a obarví.
Fixace tkáně
Účelem fixace je zabránit autolýze a hnilobě tkáně. Pro dosažení nejlepších výsledků se biologické vzorky tkání ihned po odběru přenesou do fixačního činidla. Nejčastějšími typy jsou chlorid rtuťnatý, formaldehyd a glutaraldehyd. Jednotlivé druhy se používají podle tkáně, která se fixuje.
Zalévání tkání
Pro zpracování tkání na tenké mikroskopické řezy je potřeba tkáň zalít do média a získat homogenní blok. Obvykle se využívá parafín, případně nitrocelulóza. Nejprve se vzorek dehydratuje a ponoří do alkoholu, aby se z tkáně odstranila voda a formalín. Většina využívaných médií totiž není mísitelná s vodou.
Následuje čištění organickým rozpouštědlem, které odstraní alkohol a umožní infiltraci parafínem. Následně se tkáň obklopí velkým blokem roztaveného parafínu a po ztuhnutí už se vzorek řeže na velmi tenké řezy.
Krájení tkáně
Po předchozích krocích je vzorek připravený na rozřezání na sklíčko. Z povrchu bloku se odstraní vosk, aby se tkáň odkryla, a zchladí se na 10 minut. Pomocí mikrotomu se z bloku odříznou extrémně tenké řezy tkáně ve tvaru pásku. Většina tkání se řeže na tloušťku 5 µm, nicméně mikrotom zvládá nastavení řezání na různou tloušťku.
Po nařezání se tkáň opatrně přenese do teplé vodní lázně, kde se nechá chvíli plavat na hladině. Nakonec se nabere na sklíčko, zřetelně se označí a nechá se vyschnout ve svislé poloze při 37 °C, aby se jemně rozpustil přebytečný parafín a tkáňový řez zůstal neporušený.
Barvení tkáně
Většina buněk je průhledná a v původním stavu se jeví jako téměř bezbarvá. Proto se používají histochemická barviva (obvykle hematoxylin, karmín nebo syntetický eosin), která zajistí kontrast tkáňových řezů. Díky tomu jsou tkáňové struktury viditelnější a snadněji se hodnotí. Barviva reagují fyzikálně nebo chemicky. Metoda a konkrétní barvivo se určují podle toho, které určité tkáně či buňky je potřeba zvýraznit.
Atlas histologických preparátů a digitalizace
Digitalizace samotného histologického preparátu není jednoduchá. Ideální je skenovat sklíčko v několika rovinách zaostření kvůli možné ztrátě informací. Tím se výrazně zvyšuje (nejen) časová náročnost. Navíc u preparátu v základním barvení nelze provést imunochemické barvení nebo molekulárně biologickou analýzu. To limituje odborníky při konzultacích, jelikož nedokážou provést dodatečné testy.
Výhody ovšem často převyšují nevýhody. Specialista nemusí být při konzultaci fyzicky přítomen, při výuce mají studenti nepřeberné množství materiálů, k dokumentaci pacienta mohou být přiložené veškeré informace a podobně. Tvoří se proto histologické atlasy, které vznikají především s podporou Ústavu histologie. Mezi nejrozšířenější patří:
Histologické vyšetření
Při histologickém vyšetření se vzorek tkáně odebírá co nejrychleji a nejšetrněji, aby nedocházelo ke zhmoždění tkání a aby byl zákrok pro pacienta bezbolestný. Technika se podřizuje tomu, za jakých podmínek k odběru vzorku dochází: excize se provádí během operace nebo pitvy, kyretáž při seškrábnutí části tkáně a podobně.
Po oddělení vzorku od organismu dochází k autolýze a rychlému znehodnocování, proto je potřeba vzorek co nejrychleji zafixovat. Vloží se do fixační nádobky s fixačním roztokem, jehož musí být nejméně 20× více, než kolik činí objem vzorku. Pečlivě označená nádobka putuje s průvodním vyplněným listem do histologické laboratoře, kde vzorek zaevidují a zpracují.
Pro přenos a zpracování se využívá jen zdravotnický materiál k tomu určený. Jakékoliv vystavování okolním vlivům vzorek znehodnocuje a ovlivňuje správné stanovení diagnózy.
Příprava histologických preparátů a histologické atlasy
Histologické vyšetření je důležité pro stanovení diagnózy nebo jako metoda vědecké práce. Nejdříve je ale potřeba zhotovit histologické preparáty, které jsou pro diagnózu klíčové. Jejich vytvoření není jednoduché, proto vědci a lektoři českých univerzit dali vzniknout několika histologickým atlasům.
K čemu slouží histologický preparát?
Histologické preparáty jsou mikroskopické preparáty, které slouží pro studium a buněčnou diagnostiku živých tkání. Díky preparátu dokáže medik prozkoumat mikroskopické struktury tkání, stanovit diagnózu a vyloučit případné patologie.
Histologie je ideální pro zobrazování celých tkání s nižším rozlišením, ale je omezující, pokud chcete zkoumat subcelulární struktury, například při studiu změn u mozkových nádorů. V takovém případě je zapotřebí podrobnější a výkonnější technika, jako je elektronová mikroskopie.
Zhotovení histologických preparátů
Příprava histologických preparátů se rozděluje do několika fází. Nejdříve je potřeba tkáně a buňky šetrně usmrtit, aby si zachovaly charakteristický tvar a strukturu. Následně se nařežou na tenké řezy a obarví.
Fixace tkáně
Účelem fixace je zabránit autolýze a hnilobě tkáně. Pro dosažení nejlepších výsledků se biologické vzorky tkání ihned po odběru přenesou do fixačního činidla. Nejčastějšími typy jsou chlorid rtuťnatý, formaldehyd a glutaraldehyd. Jednotlivé druhy se používají podle tkáně, která se fixuje.
Zalévání tkání
Pro zpracování tkání na tenké mikroskopické řezy je potřeba tkáň zalít do média a získat homogenní blok. Obvykle se využívá parafín, případně nitrocelulóza. Nejprve se vzorek dehydratuje a ponoří do alkoholu, aby se z tkáně odstranila voda a formalín. Většina využívaných médií totiž není mísitelná s vodou.
Následuje čištění organickým rozpouštědlem, které odstraní alkohol a umožní infiltraci parafínem. Následně se tkáň obklopí velkým blokem roztaveného parafínu a po ztuhnutí už se vzorek řeže na velmi tenké řezy.
Krájení tkáně
Po předchozích krocích je vzorek připravený na rozřezání na sklíčko. Z povrchu bloku se odstraní vosk, aby se tkáň odkryla, a zchladí se na 10 minut. Pomocí mikrotomu se z bloku odříznou extrémně tenké řezy tkáně ve tvaru pásku. Většina tkání se řeže na tloušťku 5 µm, nicméně mikrotom zvládá nastavení řezání na různou tloušťku.
Po nařezání se tkáň opatrně přenese do teplé vodní lázně, kde se nechá chvíli plavat na hladině. Nakonec se nabere na sklíčko, zřetelně se označí a nechá se vyschnout ve svislé poloze při 37 °C, aby se jemně rozpustil přebytečný parafín a tkáňový řez zůstal neporušený.
Barvení tkáně
Většina buněk je průhledná a v původním stavu se jeví jako téměř bezbarvá. Proto se používají histochemická barviva (obvykle hematoxylin, karmín nebo syntetický eosin), která zajistí kontrast tkáňových řezů. Díky tomu jsou tkáňové struktury viditelnější a snadněji se hodnotí. Barviva reagují fyzikálně nebo chemicky. Metoda a konkrétní barvivo se určují podle toho, které určité tkáně či buňky je potřeba zvýraznit.
Atlas histologických preparátů a digitalizace
Digitalizace samotného histologického preparátu není jednoduchá. Ideální je skenovat sklíčko v několika rovinách zaostření kvůli možné ztrátě informací. Tím se výrazně zvyšuje (nejen) časová náročnost. Navíc u preparátu v základním barvení nelze provést imunochemické barvení nebo molekulárně biologickou analýzu. To limituje odborníky při konzultacích, jelikož nedokážou provést dodatečné testy.
Výhody ovšem často převyšují nevýhody. Specialista nemusí být při konzultaci fyzicky přítomen, při výuce mají studenti nepřeberné množství materiálů, k dokumentaci pacienta mohou být přiložené veškeré informace a podobně. Tvoří se proto histologické atlasy, které vznikají především s podporou Ústavu histologie. Mezi nejrozšířenější patří:
Histologické vyšetření
Při histologickém vyšetření se vzorek tkáně odebírá co nejrychleji a nejšetrněji, aby nedocházelo ke zhmoždění tkání a aby byl zákrok pro pacienta bezbolestný. Technika se podřizuje tomu, za jakých podmínek k odběru vzorku dochází: excize se provádí během operace nebo pitvy, kyretáž při seškrábnutí části tkáně a podobně.
Po oddělení vzorku od organismu dochází k autolýze a rychlému znehodnocování, proto je potřeba vzorek co nejrychleji zafixovat. Vloží se do fixační nádobky s fixačním roztokem, jehož musí být nejméně 20× více, než kolik činí objem vzorku. Pečlivě označená nádobka putuje s průvodním vyplněným listem do histologické laboratoře, kde vzorek zaevidují a zpracují.
Pro přenos a zpracování se využívá jen zdravotnický materiál k tomu určený. Jakékoliv vystavování okolním vlivům vzorek znehodnocuje a ovlivňuje správné stanovení diagnózy.